关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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Frdbio® EdU-647荧光法细胞增殖成像检测试剂盒


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产品品牌:Frdbio 产品货号:CPK0024
保存温度:2-8 有效日期:24个月
英文名称:Frdbio® EdU-Fluor 647 Cell Proliferation Imaging Kit
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产品介绍:

BrdU 作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物(其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C 原子连接的甲基被溴代替),像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA 中。当细胞处于DNA 合成期(S 期),在培养基中加入BrdU,其就会掺入新合成的DNA中,这种BrdU 就在胞核的DNA 中长期存留;再通过HRP标记的BrdU单克隆抗体,就可以通过TMB底物显色检测细胞增殖和活力情况。这种方法的缺点是;实验步骤繁琐,并且在加入抗体之前,要充分变性DNA,才能使BrdU单克隆抗体顺利结合到掺入BrdU的DNA上,同时破环了其DNA双链结构,影响其他染料的结合。如果变性不充分,实验很容易失败。

本试剂盒所用的核酸类似物为EdU,其掺入新合成DNA的原理和过程BrdU相同;EdU的集团上还有一个炔基团,与下游的荧光染料上的叠氮基团,在一价铜离子催化下,发生Click chemistry反应,也就是大家翻译成中文的点击化学。本方法与BrdU相比的主要优势是操作的流程更简单,并且EdU分子只有抗体分子的1/500,不需要DNA的变性步骤;从效果上来说,EdU比BrdU有更好的灵敏度和准确度。

注意事项:

荧光试剂很容易淬灭,因此实验过程中尽可能选择早期时间观察记录结果,同时注意避光,以减缓淬灭;

为了您的安全,实验过程中请注意佩戴手套。

 

 

其他需要自备试剂材料:

1×PBS(pH 7.2-7.6)

• 细胞固定液(含 3.7%甲醛的 PBS)

• 细胞透膜液(含 0.5% Triton® X-100 的 PBS)

    1×Hoechst 33342 染色液

• 含 3% BSA 的 PBS(pH 7.4)

• 去离子水

• 18×18 mm 盖玻片

各种规格吸头及移液细胞培养耗材。

 

试剂盒储存:

2-8°C,避光,干燥,不要冻存。。

 

试剂盒操作流程图:

细胞爬片制备(细胞铺板培养)→细胞处理(可选)→EdU与细胞共培养→细胞固定及细胞膜透化处理→检测EdU(click chemistry)→抗体或者其他染料染色→图像捕获及分析

具体使用操作方法:

1.   EdU的标记

正式实验前,最好做预实验,以确定最佳的标记浓度,因为细胞类型,细胞密度,细胞培养基及培养条件不同,最佳包被浓度也不尽相同。预实验的时候,建议从10uM的浓度做几个浓度的梯度来确定最佳使用浓度。

1.1将洗净灭菌的盖玻片放入细胞培养板孔,将合适浓度的细胞铺到盖玻片上,待细胞贴壁及正常生长到合适的密度;

1.2 EdU溶液用培养基稀释到20 μM EdU 初始浓度,使用的时候,加入与细胞培养液相同体积的以上工作液;例如实验时,细胞培养液为200ul,吸去100ul培养液,然后加入100ul EdU溶液即可;

1.3细胞重新放入培养箱培养,培养的时间长度和培养条件是根据细胞类型确定的,确切的说就是根据细胞生长速度和周期确定的。

以下信息仅供参考:人胚胎细胞细胞周期约30分钟,EdU培养 5-10分钟;人的神经细胞周期是5天,EdU培养 24小时;人的其他细胞一般生长周期20小时左右,EdU培养 2小时左右。

2.   细胞固定及膜透化处理

吸干细胞培养液,将含有细胞爬片的板孔内加入1ml细胞固定液(含3.7%甲醛的PBS)室温固定细胞15分钟

吸干细胞固定液,每孔用1ml洗涤液(3% BSAPBS)浸泡5分钟;

吸干细胞清洗液,每孔加入1ml细胞膜透化液(含0.5%TritonX-100,室温进行膜透化处理20分钟。

3.   EdU的检测

3.1  10XEdU检测液的配制,将试剂EdU管内加入1ml去离子水,即为10XEdU检测液,使用后及时存放在-20℃,可以稳定保存1年。

3.2  EdU检测工作液配制:用去离子水将10XEdU检测液稀释10倍,即为EdU检测工作液(比如,需要1mlEdU检测工作液,10XEdU检测液100ul,加入900ul去离子水,混匀即可),现配现用,不可储存备用。

3.3  EdU检测反应体系配置,参照下表配制,现配现用,存储不超过20分钟。

 

EdU检测反应体系参考表(各组分体积单位:ul)

试剂组分

盖玻片数量

5

10

Reaction Buffer

430

860

CuSO4

20

40

Flour azide

1.5

3

EdU检测工作液

50

100

总体积

500

1000

3.4  配制EdU检测反应体系的同时,立即吸干细胞膜透化液,每孔加入1ml3% BSAPBS浸泡清洗5分钟,重复一次;

 

3.5 吸干清洗液,每孔加入100ul EdU检测反应液,

3.6 室温避光反应30分钟

3.7吸干EdU检测反应液,入1ml3% BSAPBS浸泡清洗5分钟,重复1-2次。

某些细胞贴壁能力较强,背景会偏高,可以使用甲醇清洗1-2次,再用含3% BSAPBS浸泡清洗5分钟,重复1-2次。

 

4.   染色细胞核(如果需要)

推荐选用 1×Hoechst 33342进行DNA染色

染色的步骤如下:

4.1 每孔加入 1 ml PBS 浸泡清洗细胞,吸干细胞清洗液。

4.2 配制1×Hoechst 33342 染色液。

4.3 每孔加入 200 μl 1×Hoechst 33342 染色液。室温孵育 15 分钟,注意避光。吸干 Hoechst 33342 染色液。

4.4 每孔加入 1 ml PBS 浸泡清洗细胞 5 分钟,重复一次。吸干PBS

5.   5. 成像及分析

将细胞爬片晾干,封片,选择合适的波长在荧光显微镜下观察并记录图像。


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