关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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Anti-DYKDDDDK Affinity Beads


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产品品牌:Frdbio 产品货号:IGP0018
保存温度:2~8°C 有效日期:12个月
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Anti-DYKDDDDK Affinity Beads

1.产品介绍

Flag标签是一个由八个亲水 氨基酸组成的多肽片段,定位在融合蛋白表面,因此更易与抗体结合以及被肠激酶分解。Anti-DYKDDDDK Affinity Beads是以抗Flag(DYKDDDDK)抗体为亲和配体,-步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的Flag标签融合蛋白。Anti-DYKDDDDK Affinity Beads以4%琼脂糖凝胶为基质,杂蛋白非特异性结合少,可用于Flag标签融合蛋白的纯化和免疫沉淀(IP)。

表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能

指标

性能

基质

高度交联的4%琼脂糖微球

配体

Anti-DYKDDDDK人单克隆抗体

结合能力

>1mg DYKDDDDK标签蛋白/ml 介质

粒径 (μm)

45-165

最大压力

0.1MPa, 1 bar

储存缓冲液

1×PBS,0.02%NaN3

储存温度

2-8°C

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。

样品在.上样前建议离心或用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 um滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4

酸性洗脱液: 0.1 M glycine HCI, pH3.0

竞争性洗脱液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCI, 100-500 μg flag多肽/ml, pH7.4

中和液: 1 M Tris-HCl, pH8.0

3.样品纯化

3.1柱层析

1)将Anti-DYKDDDDK Affinity Beads装入合适的层析柱,层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

2)将样品加到平衡好的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads中,收集流出液,可以反复上样增加结合效率。

3)用10倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。

4)A酸性洗脱:使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱,收集管中预先加好中和液,加入量15-25ul中和液/ml洗脱液,分管收集。注:酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡,Anti-DYKDDDDK Affinity Beads在洗脱液中不要超过20 min。

B竞争性洗脱:使用5倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

5)使用3倍柱体积的洗脱液再生,然后用平衡液平衡至中性。

6)然后保存在含0.02%叠氮化钠的PBS溶液中,2-8℃保存。

3.2静态吸附

1)填料准备:取适量的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads加入层析柱中,流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。

2)加入样品溶液,4℃或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌),确保填料与样品溶液充分混合。

3)孵育完毕后,将填料混合液离心(5000xg 离心1 min)或过滤收集填料。

4)将填料装入层析柱中,用平衡液清洗直至紫外稳定。

5)用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱,参考3.1中4)。

6)填料再生和保存参考3.1中5)和6)。

3_3免疫沉淀操作流程

1)填料准备:取40 μl的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads (柱体积20 u1)混合液加入到2 ml离心管中, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。

2)填料加入0.5 ml平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用), 5000xg离心1 min,吸弃上清。重复-次。

3)加入200-1000ul样品裂解液到处理好的填料中,混合均匀,在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管,促使样 品和填料充分接触并吸附,室温至少1h。5000xg 离心1 min,吸弃上清。

4)洗杂:加入0.5 ml的洗杂液,悬浮填料,轻轻混匀, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

5)样品洗脱:可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A:酸性洗脱

加入100μl酸性洗脱液,悬浮填料。室温孵育5 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料,用中和液中和。洗脱样品放置4℃,长时间放置20℃保存。

B:竞争性洗脱

加入100ul竞争性洗脱液洗脱。室温孵育30 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料。洗脱样品放置4℃,长时间放置-20℃保存。

C:变性洗脱

实验室常规蛋白.上样缓冲液(Loading Buffer)中含有β巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-DYKDDDDK抗体变性,洗脱后的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads没办法重复使用。每管中加入20 ul 2x Loading Buffer, 95℃加热5min。5000xg 离心1 min,吸取上清SDS-PAGE电泳检测。

4.试剂兼容性

表2.Anti-DYKDDDDK Affinity Beads 试剂兼容性

试剂名称

最大耐受浓度

备注

β-巯基乙醇

10mM

纯化过程中应避免使用,如果在IP中使用,填料不能回收重复使用

DTT

80mM

SDS

-

EDTA

5mM

过高的EDTA会降低蛋白回收率

Tween-20

5%

过高浓度会影响标签蛋白结合效率

Triton X-100

5%

NP40

4%

盐酸胍

0.3M

过高浓度会使抗体变性

尿素

1.5M

甘油

20%

过高浓度会影响标签蛋白结合效率

NaCl

1M

减少非特异性吸附

4.问题及解决方案

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

筛板被堵塞

清洗或更换筛板

填料被堵塞

按照第4部分进行树脂CIP清洗

裂解液中含有微小的固体颗粒,建立上柱前过滤

样品纯化过程中曲线不稳

样品或buffer中有气泡

取出样品或柱子中的气泡

样品和buffer进行脱气

 

洗脱组分中没有目的蛋白

目的蛋白不稳定

使用新鲜样品

低温操作

细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂

样品中无标签融合蛋白

纯化前Western检测是否有c-myc标签蛋白

回收率逐渐减低

上样量太多

减少上样量

柱子太脏

按照第4部分进行树脂CIP清洗

*本试剂仅供实验室研究使用

 


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