关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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Anti-c-Myc Affinity Beads


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产品品牌:Frdbio 产品货号:IGP0017
保存温度:2~8°C 有效日期:12个月
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Anti-c-Myc Affinity Beads

1.产品介绍

Anti-c-Myc Affinity Beads可以检测原核、真核表达的c-Myc标签融合蛋白。c-Myc 多肽是由人类染色体8q24.上的c-Myc基因编码,对应于人类P62的410-419 (EQKLISEEDL) 氨基酸。Anti=c-Myc Affinity Beads可以识别C端,N端或内部c-Myc标签蛋白融合蛋白,可应用在Western-blot 杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能

指标

性能

基质

高度交联的4%琼脂糖微球

配体

Anti-c-Myc人单克隆抗体

结合能力

>1mg c-Myc标签蛋白/ml 介质

粒径 (μm)

45-165

最大压力

0.1MPa, 1 bar

储存缓冲液

1×PBS,0.02%NaN3

储存温度

2-8°C

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。样品在上样前建议离心或用0.22 μm0.45 μm滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm0.45 μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4

酸性洗脱液: 0.1 M glycine HCI, pH3.0

竞争性洗脱液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 100-500 μg c-Myc多肽/ml, pH7.4

中和液: 1 M Tris-HCl, pH8.0

3.样品纯化

3.1柱层析

1)Anti-c-Myc Affinity Beads装入合适的层析柱,用5倍柱体积的平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

2)将样品加到平衡好的Anti- c-Myc Affinity Beads,收集流出液,可以反复上样增加结合效率。

3)10-50倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。

4) A酸性洗脱:使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱,收集管中预先加好中和液,加入量10-20 μl中和液/ml洗脱液,分管收集。注:酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡, Anti- c-Myc Affinity Beads在洗脱液中不要超过20 min

B竞争性洗脱:使用5倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

5)使用3倍柱体积的洗脱液再生,然后用平衡液平衡至中性。

6)然后保存在含0.02%叠氮化钠的PBS溶液中,2-8"C保存。

3.2静态吸附

1)填料准备:取适量的Anti- c-Myc Affinity Beads加入层析柱中,流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。

2)加入样品溶液,4C或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌),确保填料与样品溶液充分混合。

3)孵育完毕后,将填料混合液离心(5000xg 离心1 min)或过滤收集填料。

4)将填料装入层析柱中,用平衡液清洗直至紫外稳定。

5)用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱,参考3.14)

6)填料再生和保存参考3.15)6)

3.3免疫沉淀操作流程

1)填料准备:40μlAnti-c-Myc Affinity Beads (柱体积20 ul)混合液加入到1.5 ml离心管中, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。

2)填料平衡:加入0.5 ml平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用)5000xg 离心1 min,吸弃上清。重复一次。

3)样品结合:加入200-1000 μl样品裂解液或细胞抽提物到处理好的填料中,混合均匀,在室温下置于混合仪轻轻翻转离心管,促使样品和填料充分接触并吸附,室温至少1 h5000xg 离心1 min,吸弃上清。

4)洗杂:加入0.5 ml的洗杂液,悬浮填料,轻轻混匀,5000xg 离心1 min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

5)样品洗脱:可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A:酸性洗脱

加入100 ul酸性洗脱液,悬浮填料。室温孵育5 min, 5000xg 离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料,用中和液中和。洗脱样品放置4℃,长时间放置20"C保存。

B:竞争性洗脱

加入100 μl竞争性洗脱液洗脱。室温孵育30 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料。洗脱样品放置4C,长时间放置-20°C保存。

C:变性洗脱

实验室常规蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)中含有巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-c-Myc抗体变性,洗脱后的Antic Myc Affinity Beads没办法重复使用。每管中加入20 ul 2x Loading Buffer, 95"C 加热5 min5000xg 离心1 min,吸取上清SDS PAGE电泳检测。

4.问题及解决方案

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

筛板被堵塞

清洗或更换筛板

填料被堵塞

按照第4部分进行树脂CIP清洗

裂解液中含有微小的固体颗粒,建立上柱前过滤

样品纯化过程中曲线不稳

样品或buffer中有气泡

取出样品或柱子中的气泡

样品和buffer进行脱气

 

洗脱组分中没有目的蛋白

目的蛋白不稳定

使用新鲜样品

低温操作

细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂

样品中无标签融合蛋白

纯化前Western检测是否有c-myc标签蛋白

回收率逐渐减低

上样量太多

减少上样量

柱子太脏

按照第4部分进行树脂CIP清洗

*本试剂仅供实验室研究使用

 


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