抗体的纯化——Protein A 、G、L亲和纯化

Protein A具有和IgG的Fc片段结合的活性。Protein A能与大部分哺乳动物的IgG反应,不同属种的抗体对Protein A的亲和力不同；据此可将Protein A作为配基结合在琼脂糖凝胶上用于分离IgG亚类,一步纯化所得抗体的纯度大于99%;洗脱液的抗体浓度大于10 g/ L;适用于所有人源的(非IgG3)抗体和Fc融合蛋白。

Protein G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、α2-巨球蛋白相结合,这使得用Protein G亲和色谱提纯抗体,无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前这一问题已经通过基因修饰的方法表达Protein G得以解决。

Protein L与蛋白A和蛋白G结合到（抗体）的Fc区不同的是，蛋白L通过轻链相互作用结合抗体。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用，蛋白L结合更宽范围的抗体类大于蛋白A或G蛋白，Protein L结合所有抗体类，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。Protein L蛋白结合仅限于那些含有κ轻链的抗体，Protein L结合人的κI，III，IV和小鼠的κI 轻链亚型；Protein L还可以结合单链抗体和Fab片段。 

具体步骤如下：

1. 血清预处理: 0.22孔径滤器过滤血清，与等体积PBS(pH7.4)混合，调至pH7.8，此时亲和挂柱效果较好。

2. 平衡亲和柱:用10倍体积的PBS(pH7.4)清洗柱子，同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪进液口连接固定。

3. 上样：PBS平衡柱体时，调节核酸蛋白检测仪数值稳定在0左右，将样品加入上样柱床，核酸蛋白检测仪上数值慢慢升高，收集液体（此液体简称流穿液，流穿液中可能还会有未被柱子捕获的抗体，所以暂时收集以再次过柱纯化使用），

4. 上样完毕后，用PBS（pH7.2）洗杂蛋白，当核酸蛋白检测仪的数值下降到平衡数值，不再下降时，停止收集流穿液。

5. 抗体洗脱：当核酸蛋白检测仪的数值保持较低数值并稳定时，待柱床液面快流干时，轻轻在柱床上加入洗脱液（0.1M Gly-HCl，pH2.7），尽量不要冲起柱床；当核酸蛋白检测仪上数值迅速升高时，迅速顺次分管承接洗脱的液体，并迅速用中和液（0.5M Tris-Cl，pH8.0）中和，承接时宜多管顺次接取，并记录顺序。

6. 洗脱完毕后，当数值变低并不再变动时，用至少5倍柱床体积的PBS以 2～4 ml/min流速清洗平衡柱子。

7. 柱床用保存液（含20%乙醇的PBS）保存，并封闭柱子上下两端，4 ℃保存。

8. 抗体对PBS(pH7.2)透析3次，每次4h以上。

9. 测抗体浓度，并通过SDS-PAGE分析抗体纯度。