单克隆抗体制备——细胞株的冻存与复苏

1. 细胞株的冻存：杂交瘤细胞冻存是单抗中重要环节。

1.1 将处于对数生长期的杂交瘤细胞重悬起来，1,500rpm离心5min，去除上清。

1.2 加入适量的细胞冻存液（10% DMSO，20%～50%胎牛血清，1640培养基），轻轻吹打重悬细胞，使终浓度达到0.5～1×107个/ml。

1.3 将细胞分装入细胞专用冻存管，每管1.0～1.5ml，在管子上标准细胞名称、冻存日期和冻存人。

1.4 冻存降温程序：-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

（如果实验室的实验条件受限，可以采取以下的操作流程：-20℃冰箱2h ，-70℃冰箱过夜，然后移入液氮中；还可以直接将细胞冻存管裹上厚厚的棉套，直接放入-80℃冰箱过夜，次日转入液氮保存。

1.5 细胞冻存中常用冻存液为DMSO,DMSO的纯度对冻存细胞至关重要，建议使用细胞冻存专用级别的。

1.6 细胞融合孔检测到阳性，如果来不及亚克隆往往只能忍痛看着细胞株丢失，福因德生物为了解决此类问题专门研发96孔板整板细胞冻存液，冻存液使用方便，加入冻存板直接放入-80℃冰箱即可。）

2. 单克隆细胞株细胞复苏

2.1 从液氮容器中取出细胞冻存管，迅速浸入37℃温水中不断摇动令其尽快融化。

2.2 待其完全融化，取出冻存管，打开盖子，吸取细胞悬液转移到离心管，并滴加10倍以上不完全培养基，混匀。

2.3 离心， 1,500rpm，5min。

2.4 弃上清液，加入含10%胎牛血清完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种到培养瓶中，37℃培养箱静置培养。

2.5 次日更换一次培养液，继续培养。

（将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。冻存和复苏最好用新配制的培养液。）