关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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从单B细胞克隆和表达人单克隆抗体的策略

来源:frdbio发布时间: 2023-12-14 15:23:56丨 522人浏览

IgH 和 IgL 链基因通过巢式 RT-PCR 从单细胞 cDNA 中扩增,该 cDNA 是通过随机六聚体扩增产生的,然后连接到真核表达载体中。 使用对前导区具有特异性的正向引物混合物和对相应 IgH、Igκ 或 Igλ 恒定区具有特异性的反向引物进行第一次 PCR。 使用对 FWR1 具有特异性的正向引物混合物和对 IgH、Igκ 和 Igλ J 基因或恒定区具有特异性的相应嵌套反向引物进行第二次 PCR。 如果第二个PCR引物含有限制性位点,则对产物进行测序并直接克隆。 或者,为了避免使用引物混合物引入氨基酸交换以及为了克隆全长 Igκ 基因,对第二次 PCR 产物进行测序以确定各自的 V 和 J 基因。 之后,以第一次PCR产物为模板,使用含有限制性位点的V基因和J基因特异性引物进行另一轮扩增。 所有 PCR 产物在表达载体克隆之前和之后均进行测序。 为了生产重组抗体,将含有与原始 PCR 产物具有 100% 同一性的插入片段的质粒共转染至 HEK 293 细胞中,并在培养后从上清液中纯化抗体。

附1.细胞分选标志物表型

SourceB cell populationPhenotype
Bone marrowEarly immatureCD19+CD34−CD10+IgM−
ImmatureCD19+CD34−CD10+IgM+
Peripheral bloodNew emigrantCD19+CD10+CD27−IgM+
Mature naiveCD19+CD10−CD27−IgM+
IgM+ memoryCD19+CD10−CD27+IgM+
IgG+ memoryCD19+CD10−CD27+IgG+


附2:相关引物序列:


Forward Primer5′ - 3′ sequence

5′ L-VH 1ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
5′ L-VH 3AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5′ L-VH 4/6CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5′ L-VH 5CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

5′ AgeI VH1CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG
5′ AgeI VH1/5CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG
5′ AgeI VH3CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG
5′ AgeI VH3-23CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG
5′ AgeI VH4CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG
5′ AgeI VH 4-34CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG

5′ AgeI VH 1-18CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG
5′ AgeI VH 1-24CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG
5′ AgeI VH3-33CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG
5′ AgeI VH 3-9CTGCAACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAG
5′ AgeI VH4-39CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG
5′ AgeI VH 6-1CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG

5′ L Vκ 1/2ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
5′ L Vκ 3CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
5′ L Vκ 4ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG

5′ Pan VκATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG

5′ AgeI Vκ 1-5CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC
5′ AgeI Vκ 1-9TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
5′ AgeI Vκ 1D-43CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC
5′ AgeI Vκ 2-24CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC
5′ AgeI Vκ 2-28CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC
5′ AgeI Vκ 2-30CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC
5′ Age Vκ 3-11TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
5′ Age Vκ 3-15CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC
5′ Age Vκ 3-20TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
5′ Age Vκ 4-1CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC

5′ L Vλ 1GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG
5′ L Vλ 2GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
5′ L Vλ 3GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5′ L Vλ 4/5GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
5′ L Vλ 6GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5′ L Vλ 7GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
5′ L Vλ 8GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG

5′ AgeI Vλ 1CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACKCAG
5′ AgeI Vλ 2CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG
5′ AgeI Vλ 3CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACWCAG
5′ AgeI Vλ 4/5CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACTCA
5′ AgeI Vλ 6CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACTCAG
5′ AgeI Vλ 7/8CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACYCAG

5′ Ab senseGCTTCGTTAGAACGCGGCTAC

Reverse Primer5′ - 3′ sequence

3′ Cγ CH1GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
3′ Cμ CH1GGGAATTCTCACAGGAGACGA
3′ IgG (internal)GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

3′ SalI JH 1/2/4/5TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
3′ SalI JH 3TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG
3′ SalI JH 6TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG

3′ Cκ 543GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA

3′ Cκ 494GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

3′ BsiWI Jκ 1/4GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
3′ BsiWI Jκ 2GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC
3′ BsiWI Jκ 3GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC
3′ BsiWI Jκ 5GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC

3′ CλCACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG

3′ XhoI CλCTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG




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